磁性粒子在蛋白质分离纯化中的应用

• 2012-04-17
• 专题

早在20世纪40年代，磁性氧化铁就被用于吸附和去除溶解在废水中的胶状物。20世纪70年代，Robins等¹⁾首次将磁性粒子用作固定化酶的载体。此后，又将其用于选择性捕获生物分子，利用表面带有氨基的硅烷化磁性粒子从大肠埃希氏菌中分离纯化了B2半乳糖有²⁾。随后的20年间，磁性粒子用于生物分子分离的研究发展缓慢。进入21世纪，将磁性粒子作为吸附剂直接从生物样品中分离生物分子引起了广泛关注，对磁性粒子的研究日益活跃，相关的文献报道迅速增加。并目，Chemagen、Micromod、Dynal等一些公司己推出了性能良好的商品化磁性粒子。日前，磁性粒子的应用己扩大到生物大分子(如蛋白质、核酸)分离、靶向药物、免疫分析、细胞标记和细胞分离以及环境监测等领域。

近年，随着蛋白质组学研究的快速发展，磁性粒子用于蛋白质分离纯化的研究发展迅速，其在解决蛋白质快速分离和高特异的选择性分离方面，具有高效、快速的优势。磁性粒子用于蛋白质分离是指以纳米或微米级的磁性材料为载体，通过对此磁性载体的表面进行修饰，使其能够特异性吸附目标蛋白质，进而在外加磁场的作用下实现与原样品溶液组分快速分离。分离后的磁性粒子再经过清洗、解吸附等操作即可得到目标蛋白质。此法具有分离方法与设备简单、操作方便快捷、处理样品量大、分离的选择性与特异性好、纯度与回收率高等优点。本文综述了2005年以来有关磁性粒子在蛋白质分离纯化中的研究进展。

1磁性粒子与磁性分离的特性

磁性粒子是指因含有磁性金属或金属氧化物(如Fe、Co、Ni及其氧化物)的超细粉末而具有磁响应性的粒子。磁性粒子一般为核硫型结构，以含磁性材料的超细粉末组成核，核外层的功能高分子材料组成壳层:或者以功能高分子材料为核，核外层包覆的磁性材料作壳层:也可做成夹心结构，外、内层均为功能高分子材料，中间层为磁性材料:还有混合型，即由磁性材料和功能高分子材料混合而成的多核结构^3-5)。由于磁性物质中的Co、Ni表现出很强的生物毒性和化学不稳定性，其应用范围受到限制；日前应用最多的磁性材料是Fe₃O₄，其稳定性较好，对生物体的毒害作用小，目制备方法简单，粒度、形状和组成可通过合成条件加以控制。

将磁性粒子用于蛋白质的分离纯化最好选择稳定性好、有一定生物相容性的磁性材料。使用的磁性粒子需要具有以下特性：(1)良好的表面效应和体积效应。随着粒子比表面积的增大，粒子表面的官能团密度增大，选择性吸附能力增强，因而达到吸附平衡的时间缩短，粒子的稳定性大大提高；(2)磁响应性。磁性粒子具有超顺磁性，在磁场中有较强的磁性，去掉磁场后磁性很快消失，在磁场中不被永久磁化故可在外加磁场(如磁铁)作用下，快速、方便地分离目标组分；(3)生物相容性。磁性粒子用于生物工程，特别是生物医学工程时，需要具有良好的生物相容性。磁性粒子表面包覆的高分子材料多数为如多聚糖、蛋白质、脂类等生物高分子具有良好的生物相容性，在人体内安全无毒，可降解不与人体组织器官产生免疫抗原性；( 4)表面可修饰。磁性粒子通过表面化学修饰或改性，形成带有特定功能基团或配基的壳层，能与目标蛋白质可逆性结合。从物理学角度看，Franzreb等⁶⁾认为磁性载体粒子用于分离纯化蛋白质应考虑如下因素：(l)粒子的孔径大小不足以使目标生物分子渗入；(2)拥有高特异性的表面积(20~100 m²/g)；(3)尺寸具有单分散性；( 4)在中低强度的磁场下能够很容易地被分离。

磁性分离的方法简单，可直接从原始样品中对目标蛋白质进行分离。针对目标蛋白质对磁性载体进行修饰后，将磁性粒子直接放入含有目标蛋白质的混合溶液中，表面的功能高分子材料通过离子交换作用、亲和作用或印迹位点等对蛋白质进行选择性吸附，吸附平衡后，利用外加磁场实现分离。整个分离过程在一个容器中进行，仅需根据高分子材料的特点及其与蛋白质间的不同作用方式对混合溶液的pH、温度、离子强度等进行调整，减少了传统分离方法如盐析、有机溶剂沉淀法中蛋白质的损失⁷⁾。磁性分离无需离心、过滤、色谱分离等操作，省去繁琐的样品预处理和样品分离过程；磁性粒子对蛋白质具有独特的吸附性能，用磁性粒子分离纯化蛋白质能用于任何下游操作的过程。与传统分离方法比较，蛋白质的磁分离具有快速、高效、高收率等优点。

2磁性粒子的表面修饰

磁性粒子用于蛋白质分离是基于在磁性粒子表面上修饰离子交换基团或亲和配基等可与目标蛋白质产生特异性吸附作用的功能基团，使经过表面修饰的磁性粒子在外加磁场的作用下从生物样品中快速选择性地分离目标蛋白质。因此，针对目标蛋白质选择适合的功能基团并对磁性载体表面进行修饰是选择性分离的关键。日前报道的表面修饰基团主要是阴、阳离子交换基团和亲和配基。表面修饰离子交换基团的磁性粒子较修饰亲和配基的磁性粒子应用更为广泛，但对目标蛋白质的选择性较差，其对带电性质相反的蛋白质均有静电吸附作用，非特异性吸附较为明显。表面带有亲和配基的磁性粒子对目标蛋白质有很高的特异性吸附，针对目标蛋白质的分离和纯化更有价值，但日前己知可用的亲和配基种类有限，目价格昂贵，使针对大量目标蛋白质的分离受到限制。

2.1.1修饰离子交换基团

利用阴、阳离子交换基团修饰磁性载体表面，使其表面具有荷电性。表面功能化的磁性粒子能够通过静电作用吸附带有相反电荷的蛋白质，继而通过磁场分离、清洗和解吸附步骤，实现样品中目标蛋白质的选择性分离。常用的阴离子交换基团有COOH，SO₃^-，阳离子交换基团有NH2、N(CH₂CH₃)₂。经离子交换基团衍生得到的磁性粒子有很好的纯化性能，其中，COOH和SO₃^-可与表面带正电的蛋白产生吸附。利用SO₃^-能从复杂的天然乳清样品中纯化重要的乳铁传递蛋白⁸⁾；L iao等^9、10)制备了离子交换效率高、吸附解离速度快的核壳型新型磁性纳米吸附剂Fe₃O₄/PAA聚内烯酸)，基于静电吸附原理成功分离子水相中的菠萝蛋白酶^11、12)；Bucak等¹³⁾利用磷脂包裹的磁性纳米颗粒的表面负电性选择性地分离子带有正电荷的蛋白质，吸附容量比商业化吸附剂的高出1个数量级，目没有传统多孔离子交换介质的扩散阻力:表面带有)COOH的磁性聚(甲基内烯酸缩水甘油醋却基内烯酸甲醋)微球对胰岛素的吸附容量为12312mg/g 且能保持其良好的生物活性¹⁴⁾。NH₂和N(CH₂CH₃)₂与表面带负电的蛋白有吸附作用，Sivagnanan等¹⁵⁾首次通过静电作用，将蛋白质功能化的磁球固定在修饰带正电的氨基硅烷的玻璃平板上形成微图形，该技术有利于在芯片上进行生物分子鉴定。修饰离子交

换基团的磁性粒子对不同等电点的蛋白质具有较好的分离效果。日前报道的研究主要是基于阴离子交换基团修饰的磁性粒子，阳离子交换基团修饰的较少，这可能与目标蛋白质的带电性质有关，报道的乳铁传递蛋白与菠萝蛋白酶的pH均大于7,而常见的溶菌酶、细胞色素C等蛋白质也均为碱性蛋白质，其在常规实验条件(pH约为7)时均带正电荷。

2.1.2修饰亲和配基

在磁性粒子表面修饰与目标蛋白具有特异性结合作用的亲和配基，经过亲和吸附、磁场分离、清洗和解吸附等操作可从样品中高选择性地分离目标蛋白。日前常见的用于磁性粒子表面偶联的亲和配基有：表面具有一价金属离子的亚氨基二乙酸(IDA)及次氮基二乙酸(NTA) ,链霉亲和素、生物素和蛋白A或G等，这些配基对细胞组织匀浆液等复杂样品中的目标蛋白具有很好的选择性。不同亲和配基功能化的磁性粒子适合分离不同的目标蛋白。

像IDA和NTA这样的亲和配基价廉A结合牢固，在实验中应用较多^16-19)。IDA和N TA等通过其二价金属离子(Co²⁺、Zn²⁺, Ni²⁺或者Cu²⁺)对表面暴露有半肤氨酸残基、色氨酸残基、特别是组氨酸残基的蛋白质有很好的亲和作用。Karatas等²⁰⁾基于免疫球蛋白G表面带有的大量组氨酸残基能够与过渡金属相互作用，用金属鳌合的磁性粒子从人血液中亲和去除免疫球蛋白G，其吸附的最大量达10211mg/g。Taton等²¹⁾利用水溶性磁性纳米颗粒表面的羧基，共价交联DA进而固定Cu²⁺，最后实现了对组氨酸标记的蛋白质的捕获。Kin等Cu²²⁾使用Ni ₂NT'A功能化的磁性琼脂糖球原位分离组氨酸标记的蛋白质，为重组蛋白的快速分离纯化提供了一种方法。

磁性粒子表面偶联的链霉亲和素对生物素化蛋白有较高的结合容量:表面偶联的生物素和蛋白A或G等亲和配基分别对带有链霉亲和素化蛋白和单克隆抗体的亲和性较好。日前，这些带有亲和配基的功能化磁性粒子都己实现商品化，但是价格昂贵。文献中报道的链霉亲和素功能化的磁性粒子也多是商品化产品，它能亲和固定生物素梭基载体蛋白²³⁾和生物素化的寡核有酸²⁴⁾，并从混合样品中加以分离。磁性粒子表面修饰葡萄球菌ProteinA，其与人IgG抗体的结合量为15~18mg/g能有效分离人抗血清样品中的IgG抗体²⁵⁾。另外，表面偶联甲氨蝶吟的磁性粒子，对二氢叶酸还原酶与脱氧胞有激酶有很好的亲和特性与商品化的磁性载体相比对蛋白质没有非特异性键合²⁶⁾。

3磁性粒子在蛋白质分离纯化中的应用

3.1.1对标准蛋白与修饰蛋白的分离纯化

当前，研究报道中涉及磁性粒子分离纯化蛋白的数量和种类比较集中，所用的蛋白主要为常规实验用蛋白、糖基化蛋白和磷酸化蛋白。多数报道是关于磁性粒子的基质、间隔基和配体等对分离性能的影响以及实验条件和吸附容量的研究。

3.1.2.1实验用标准蛋白的分离      牛血清白蛋白(BSA)^18,27,28)、牛血红蛋白(BHb)^16,17)、免疫球蛋白^20,25)、溶菌酶^9,29,30),组氨酸标记的蛋白^21,22)等常用蛋白作为模型蛋白研究磁性粒子分离纯化的工作较多。磁性粒子用于蛋白质分离纯化过程当中其制备方法、基质选择、表面修饰基团与粒径大小的不同都会造成对相同蛋白质吸附量的差别。

以分离纯化BSA为例，采用模板法制备单分散磁性硅胶微球，表面修饰IDA- Cu²⁺的磁性固定化金属亲和纯化载体，对BSA的饱和吸附量为90mg/g¹⁸⁾；Yang等制备的粒径为212Lm的磁性粒子对BSA的吸附容量为70mg/g²⁷⁾；采用反相悬浮包埋法制备的小粒径(有效粒径为56119rnn)壳聚糖磁性微球经戊二醛活化后对BSA的饱和吸附量为4613mg/g经Cibacron Blue 3G2A修饰后对BSA的饱和吸附量为6612mg/9²⁸⁾；磁性壳聚糖纳米粒子对BSA吸附符合Langmuir吸附模型，吸附容量为250mg/g碱性条件下能实现解吸附³¹⁾；以具有热敏性的N-异异丙基丙烯酞胺包裹磁性纳米颗粒，通过改变温度控制吸附或者解离可实现BSA的分离³²⁾。

因磁性粒子的制备方法与粒径大小不同，对BHb进行亲和分离纯化时，同样在表面引入IDA₂Cu²⁺亲和配基，而对BHb的吸附量分别为316mg/g¹⁶⁾和 543mg/g¹⁷⁾；因磁性粒子表面基质选择的不同，疏水亲和配体L2色氨酸固定的磁性聚(甲基丙烯酸缩水甘油醋)微球³³⁾和染料固定的磁性聚(甲基丙烯酸2羟乙基醋)微球³⁴⁾可以实现蛋清中溶菌酶的分离纯化，对溶菌酶的最大吸附容量分别是25916和342mg/g，对组氨酸标记的蛋白而言，Hung等³⁵⁾制备的过渡金属离子功能化的磁性粒子，能特异性结合组氨酸标记的贡组蛋白，可用来预测组氨酸标记的绿色荧光蛋白吸附到Fe₃O₄磁性纳米粒子表面的空间排列，并可直接从细胞溶解液中分离绿色荧光蛋白，最大吸附容量达865mg/g NTA-磷脂胶束包覆的功能化磁性纳米粒子，也可结合组氨酸标记的荧光蛋白，吸附容量为900-1100mg/g是商品化磁性球吸附容量的100倍³⁶⁾。

Chen等³⁷⁾将表面硅烷化的磁性氧化铁粒子作为表面辅助激光解吸附/离子化质谱的辅助材料，即将带负电荷的硅烷化磁性粒子用作亲和探针，通过调整溶液pH，从水溶液中富集微量带正电荷的细胞色素C和肌血球素，可用来分析富集小蛋白和氨基酸，最高检测质量近似为16kD，对氨基酸检测限大约为20 fnol。Yao等³⁸⁾利用C₈修饰的表面功能化磁性纳米粒子，快速从胰蛋白酶解产物和人血清中富集低丰度肤，并在磁性粒子上直接经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI2TOF2MS)对富集的目标物进行分析。Jiang等³⁹⁾用刚性单分散的磁性粒子对C2球蛋白进行吸附分离，吸附容量达到28712mg/g

3.1.2.2对糖基化、磷酸化蛋白的分离    随着对蛋白组学研究的深入展开，磁性粒子也应用于具有重要生理功能的翻译后修饰蛋白，糖基化蛋白和磷酸化蛋白的分离鉴定中。已有将凝集素、硼酸等键合到磁性粒子表面对糖蛋白或糖肤进行分离富集的报道⁴⁰⁾。Katrm等⁴¹⁾将功能化磁性球与质谱技术联用，缩短了分析过程的时间，提高了分辨率，实现了自动化。他们分别用伴刀豆球蛋白A，硼酸和麦牙凝集素功能化的磁性微粒子富集糖基化的人血清蛋白。这些功能化磁性球对不同的糖基化蛋白有特异性键合，MALDI2TOF2MS分析检测到血清蛋白中8种低丰度的糖蛋白。用间氨基苯硼酸功能化磁性球对糖蛋白进行简单的处理和富集后，MALDI2TOF2MS可直接测定磁性球上糖蛋白的含量并对其加以识别和确认⁴²⁾。Zou等⁴³⁾将磁性粒子用于固相萃取糖蛋白(SPEG)的分析中。表面带有酞肼基的超顺磁性二氧化硅粒子用作微孔平板SPEG的固定基质，其对糖蛋白的吸附容量是36mg/g是传统商品化微球的5倍，能特异性、可重复地对糖蛋白进行高通量的分离。由于糖蛋白质组学极其复杂，将磁性粒子用于糖蛋白研究，实现糖蛋白或糖肤的选择性富集具有重要意义。

此外，基于金属氧化物对磷酸化蛋白或肤段也具有富集效果，通过改变磁性粒子的性能，在磁性粒子表面包覆金属氧化物，就可在实现富集的同时，也使操作过程更为简便有效，如用Al₂O₃、ZrO₂、TiO₂等包覆的磁性粒子在磷酸化蛋白或肤段的富集方面取得了一定的成效^44,45)。Lo等⁴⁶⁾将ZrO₂包覆的氧化铁磁性粒子作为亲和探针，无需脱盐，就能直接从胰蛋白酶解产物中选择性富集磷酸肤。除用金属氧化物包覆磁性粒子外，也有少数使用金属磷化物如ZrP⁴⁷⁾包覆磁性粒子实现磷酸化蛋白的分离和富集的报道。

3.1.2磁性分离的新方法

把磁性分离与其它分离纯化技术结合，有利于提高蛋白质分离的选择性及拓宽目标蛋白的种类，提高分离效率。磁性分离与分子印迹结合、磁性分离与双水相萃取等结合有望在蛋白质分离纯化应用中发挥更大的作用。

3.1.2.1.1磁性分子印迹材料    分子印迹技术是近年来基于分子识别理论而迅速发展起来的一种新型高效分离技术，日前己广泛用于乎性拆分、生物传感器、分离纯化等领域。当使用特殊的功能聚合物分子印迹聚合物包裹磁性粒子时，可形成表面具有分子印迹的磁性材料，通过印迹位点、形状、官能团的互补作用能够更方便地分离和富集模板分子，用于蛋白质的分离纯化。该方法操作简单、选择性高，有望成为分离纯化特定蛋白质的强有力工具。

Lu等^48,49)在使用反相悬浮聚合法制备分别以牛血清白蛋白和溶菌酶为模板蛋白的印迹聚合物的过程中，加入Fe₃O₄作为磁性成分，得到了蛋白质印迹的湿软凝胶复合磁性微球。观察环境扫描电镜(ESEM)和扫描电镜(SEM )图发现，得到的印迹聚合物均为球形，湿态下有大量分布规则的孔。蛋白质印迹的磁性微球内Fe₃O₄的平均含量为2108(wt)%，在外加磁场的作用下，牛血清白蛋白和溶菌酶为模板蛋白印迹的微球均有一定的磁响应，对自身的模板分子有良好的识别选择性，各自的分离因子为4175和5188。印迹的磁性微球对模板蛋白的识别选择性主要依赖于互补产生的大量氢键陇同作用和蛋白质外表面与印迹孔穴内表面紧密的结合。当完成特异性吸附与识别之后，蛋白印迹的磁性微球能简单、快速地从体系中分离出来。Chau等⁵⁰⁾用微乳液聚合法成功制备了核糖核酸酶A印迹的亚微米粒子，形状规则，粒径为700-800nm。纳米级Fe₃O₄粒子被包裹在印迹粒子内部，包裹率较高达到1715%，使得印迹粒子具有超顺磁性。在水溶液中，它能优先吸附模板蛋白，与非模板蛋白相比，印迹粒子对模板蛋白具有高选择性，吸附容量达到12717mg/g。鉴于蛋白质体积庞大、易于变性、印迹困难的事实，Chau等⁵¹⁾又提出了一种适合蛋白质印迹的方法：共价固定模板分子的表面印迹法，并制备了牛血清白蛋白表面印迹亚微米磁性粒子。该粒子的结构与血红细胞类似，在水溶液中对模板蛋白具有非常好的识别性能。粒子内部成功包覆的Fe₃O₄纳米粒子使其具有磁性，这种超顺磁性增加了其在磁生物分离等方面的应用。而目，模板蛋白固定对蛋白质的成功印迹是十分重要的，它将有望成为一种普适性蛋白质印迹法。He等^52,53)在磁性粒子与分子印迹技术结合方面也做了较多的研究，采用溶胶凝胶法制备表面包覆硅的Fe₃O₄磁性纳米粒子，进而在模板蛋白的存在下，合成了平均粒径210nm的核壳结构牛血红蛋白印迹磁性纳米粒子。蛋白吸附结果表明，该磁性纳米粒子对模板蛋白具有高吸附能力和相对低的非特异性吸附目易达到吸附平衡在外加磁场作用下容易实现磁性分离。

3.1.2.1.2磁性分离洲水相萃取联用    双水相萃取作为一种独特的可保持生物活性的液液萃取分离技术，用于特定蛋白质的分离分配行为研究较多。近3年来，双水相萃取用于蛋白质组学研究开始得到关注^54-58)。将磁性吸附剂与双水相体系结合，用于纯化和富集蛋白质是液固吸附、液液萃取和磁性分离二者的结合，日前有关报道不多。

Becker⁵⁹⁾通过磁性吸附剂与双水相体系的结合，实现了亲水性蛋白的纯化和富集。体系温度的变化，使非离子表面活性剂Triton X2114的水溶液分离成共存的两相，形成双水相体系。其中，一相富含表面活性剂，另一相含量较少。在双水相体系中，亲水蛋白通常在表面活性剂较少的相中的分配系数较大。当将磁性吸附剂引入双水相后，两相对亲水蛋白的选择有了明显的变化。磁性吸附剂吸附目标蛋白后，使其从表面活性剂较少的相进入富含表面活性剂的相。体系中，溶菌酶(pI>1015)和卵清蛋白(pI<514)的起始浓度比是1 ：1，溶液pH为618，加入磁性阳离子交换吸附剂，溶菌酶通过静电相互作用吸附在磁性球表面，使得溶菌酶分配行为被改变，在富含表面活性剂的下相产率达74%，纯净度超过80%。不断增加体系的离子强度，吸附的溶菌酶从磁性吸附剂上解吸附下来，从而产生一个可调控的萃取体系。该方法可用于亲水性蛋白的分离。磁性粒子与双水相萃取结合也将是双水相萃取自身发展的突破点，两者结合可以加速相分离，提高生产能力⁶⁰⁾。

4结语

目前磁性离子的应用主要集中于细胞分离与核酸纯化研究，而对蛋白质的磁性分离应用相对较少。由于磁性粒子的材料、磁响应性、粒子形状与粒径、尤其是经过表面修饰的特异性吸附表面是大规模进行蛋白质分离纯化的关键，因此，磁性粒子在蛋白质分离纯化的广泛应用依赖于吸附容量高、选择性好、可重复使用、价格便宜的磁性材料的高效制备。

当前，磁性粒子针对蛋白质的分离研究大都局限在简单体系中对标准蛋白质纯品吸附的实验条件和吸附容量测定等方面，目蛋白的研究种类集中在某些常见实验用标准蛋白，对复杂体系的研究相对较少。然而，实际生物样品的组成极其复杂，蛋白的种类和数量繁多，因此应进一步开展实际样品中对特定的重要蛋白质的分离纯化的方法研究，如利用磁性分离针对高丰度蛋白和低丰度蛋白建立选择性富集和去除的快速方法，解决蛋白组学研究中的实际问题。

功能化磁性粒子及磁性粒子与其它分离技术(如双水相萃取、分子印迹技术等)的结合在蛋白质和其它生物物质分离中具有潜在的应用前景，它们各自优势和特点的结合有望发展成具有集成化优势的分离技术。随着智能高分子材料的深入研究^32,61-64)，将磁性粒子与对外界环境(如温度、pH、离子强度、光等)敏感的智能高分子材料结合，有望合成智能型磁性粒子，其在蛋白质等生物分子分离中的应用也将是未来磁性粒子发展的方向。

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注：本文为提供者翻译的，由于知识所限，其中错误在所难免，敬请原谅。如有问题可以查找原文。

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